Карин Шанн и её коллеги из Национального центра биотехнологий Испании опубликовали в журнале New BIOTECHNOLOGY единую систему тестов для оценки микробного клея. Авторы предложили методику, которая переводит сборку искусственных сообществ микробов из визуальной оценки в точные инженерные расчёты.
В современной биотехнологии бактерии объединяют в искусственные группы для решения сложных задач. Одни штаммы перерабатывают токсичные отходы в почве или воде, а другие производят компоненты для лекарств. Чтобы микробы слаженно передавали друг другу сырьё, они должны находиться в постоянном физическом контакте. Для этого исследователи встраивают в бактериальные оболочки молекулярные застёжки — специальные белки, связывающие клетки между собой.
Раньше прочность такого сцепления исследователи оценивали преимущественно по снимкам оптических микроскопов. Фотографии фиксируют сам факт образования бактериальных хлопьев, но не дают строгих цифр. По снимку нельзя точно рассчитать скорость оседания биомассы, распределение комков по величине, их устойчивость к перемешиванию и способность находить нужного партнёра среди посторонних клеток.
Три прибора вместо оценки на глаз
Испанские микробиологи объединили в один регламент три независимых инструмента: седиментационный тест, проточную цитометрию и конфокальную флуоресцентную микроскопию. Седиментация — это естественное оседание тяжёлых частиц на дно пробирки под действием силы тяжести. Исследователи смешивают бактерии в солевом растворе и измеряют на спектрофотометре мутность верхней части жидкости: когда клетки слипаются в комки, они опускаются вниз, а раствор светлеет.
Второй метод, проточная цитометрия, работает по принципу поштучного сканирования. Прибор прогоняет узкую струю жидкости с микробами через лазерный луч и за секунды регистрирует десятки тысяч частиц. По преломлению и рассеянию света датчики определяют точный размер каждого клеточного скопления и его внутреннее строение. Третий метод, конфокальная микроскопия со сверхвысоким разрешением, позволяет рассмотреть взаимное расположение бактерий, предварительно помеченных разными светящимися белками.
Прочная химическая связь против белкового замка
Для проверки методики авторы сравнили две популярные системы сцепления на лабораторном штамме кишечной палочки Escherichia coli CC118. Этот штамм выбрали после проверки пяти разновидностей бактерий, потому что он не слипается сам по себе даже за 50 часов инкубации. Первую группу клеток снабдили парой из нанотела и антигена: такие белки узнают друг друга и цепляются по принципу замка и ключа, образуя обратимую связь. Во вторую группу встроили систему SpyCatcher и SpyTag: эти белковые компоненты вступают в реакцию и формируют неразрывную химическую изопептидную связь.
В тесте на оседание бактерии с ковалентной химической связью показали явное преимущество. Через 4 часа раствор с этой системой стал прозрачным, а на дне образовался компактный осадок с комками, различимыми невооружённым глазом. Раствор с парой нанотела и антигена за то же время сохранил мутность, дав лишь рыхлый осадок на дне. Проточный цитометр подтвердил эту разницу в числах: по светорассеянию агрегаты со связкой SpyCatcher и SpyTag оказались в 104 раза крупнее и в 12 раз сложнее по строению, чем скопления клеток с нанотелами.
Затем учёные проверили механическую прочность микробных скоплений, устроив им стресс-тест. Пробирки с осадком поместили на лабораторный встряхиватель и перемешивали 10 секунд на скорости 2400 оборотов в минуту. Скопления на основе нанотел и антигенов не выдержали нагрузки: они потеряли 79% первоначального размера и 56% структурной сложности, а половина межклеточных связей разорвалась. Напротив, бактерии с ковалентной связкой выдержали встряхивание с минимальными потерями: размер их комков уменьшился на 22%, а сложность снизилась на 19%.
В следующем эксперименте исследователи оценили избирательность сцепления. К светящимся красным и жёлтым бактериям со связкой SpyCatcher и SpyTag подмешали немодифицированные синие клетки. Даже при стократном избытке посторонних синих бактерий модифицированные микробы находили друг друга и собирались в двухцветные сгустки, захватив лишь единичные синие клетки.
Границы применимости и методические погрешности
Чтобы убедиться в универсальности методики, авторы перенесли систему с ковалентным сцеплением на другой вид микробов — условно-патогенную палочку Enterobacter cloacae. В тесте на оседание мутность смеси снизилась до 50% от исходного уровня за 6 часов. Разница в прозрачности между смесью и отдельными культурами оказалась статистически ненадёжной из-за разброса данных в двух проведённых повторах. Однако проточная цитометрия и лазерная микроскопия чётко зафиксировали крупные и сложные клеточные скопления. Этот результат подтвердил главное методическое правило: один простой тест на прозрачность может давать сбой из-за строения клеточной стенки микроба, поэтому исследователям необходима триангуляция разных методов.
Авторы работы отмечают несколько естественных ограничений своего исследования. Они сопоставили только одну пару нанотело-антиген с одной ковалентной парой, поэтому делать вывод о превосходстве химических связок над всеми существующими антителами нельзя. При этом нанотела сохраняют важное практическое преимущество: они умеют связываться с естественными поверхностными белками диких микробов без внесения генетических изменений во второй штамм.
Остаются вопросы и к условиям экспериментов. Бактерии тестировали в неподвижном солевом буфере, а не в проточной питательной среде реального биореактора. Для цитометрии и микроскопии авторы отбирали пипеткой по 5 микролитров жидкости со дна пробирок, из-за чего в анализ систематически попадали самые тяжёлые хлопья, а мелкая взвесь оставалась неучтённой. Кроме того, часть опытов провели всего в двух повторностях и без контрольного белкового каркаса без насадок, поэтому для работы в промышленных масштабах технологию предстоит проверить на больших сериях образцов.
